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          【小配方】6、常用緩沖液

          日期時間:2016-01-30     文章來源:本站     點擊量:2329


          1.磷酸緩沖液

          1250.1mol/L磷酸鉀緩沖液的配制

          pH

          1mol/L K2HPO4(ml)

          1mol/L KH2PO4(ml)

          5.8

          8.5

          91.5

          6.0

          13.2

          86.8

          6.2

          19.2

          80.8

          6.4

          27.8

          72.2

          6.6

          38.1

          61.9

          6.8

          49.7

          50.3

          7.0

          61.5

          38.5

          7.2

          71.7

          28.3

          7.4

          80.2

          19.8

          7.6

          86.6

          13.4

          7.8

          90.8

          9.2

          8.0

          94.0

          6.2


          2250.1mol/L磷酸鈉緩沖液的配制

          pH

          1mol/L Na2HPO4(ml)

          1mol/L NaH2PO4(ml)

          5.8

          7.9

          92.1

          6.0

          12.0

          88.0

          6.2

          17.8

          82.2

          6.4

          25.5

          74.5

          6.6

          35.2

          64.8

          6.8

          46.3

          53.7

          7.0

          57.7

          42.3

          7.2

          68.4

          31.6

          7.4

          77.4

          22.6

          7.6

          84.5

          15.5

          7.8

          89.6

          10.4

          8.0

          93.2

          6.8

          ※:用蒸餾水將混合的兩種1mol/L貯存液稀釋至1000ml,根據Henderson-Hasselbalch方程計算其pH值:

          pH=pK’+1g([質子受體]/[質子供體])在此,pK’=6.86(25℃)。



          2.常用的電泳緩沖液

          緩沖液

          使用液

          濃貯存液(每升)

          Tris-乙酸(TAE

          0.04mol/L Tris-乙酸

          50×242g Tris

           

          0.001mol/L EDTA

          57.1ml冰乙酸

           

           

          100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

          Tris-磷酸(TPE

          1×:0.09mol/L Tris-磷酸

          10×:10g Tris

           

          0.002mol/L EDTA

          15.5ml85%磷酸(1.679g/ml

           

           

          40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

          Tris-硼酸(TBEa

          0.5×0.045mol/L Tris-硼酸

          54g Tris

           

          0.001mol/L EDTA

          27.5硼酸

           

           

          20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)

          堿性緩沖液b

          1×:50mmol/L NaOH

          1×:5ml 10mol/L NaOH

           

          1mmol/L EDTA

          2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)

          Tris-甘氨酸c

          1×:25mmol/L Tris

          5×:15.1g Tris

           

          250mmol/L 甘氨酸

          94g 苷氨酸(電泳級)(pH8.3

           

          0.1% SDS

          50ml 10% SDS(電泳級)


          說明:

          ①TBE溶液長時間存放后會形成沉淀物,為避免這一問題,可在室溫下用玻璃瓶保存溶液,出現沉淀后則予以廢棄。

          以片都以1×TBE作為使用液(即15稀釋濃貯液)進行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5×的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以110稀釋的貯存液作為使用液。

          進行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小, 故通過緩沖液的電流量通常較大,需要使用1×TBE以提供足夠的緩沖容量。

          堿性電泳緩沖液應現用現配。

          ③Tris-甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。


          2×SDS凝膠加樣緩沖液:

          100mmol/L Tris·HCl(6.8)

          200mmol/L二硫蘇糖醇(DTT

          4%SDS(電泳級)

          0.2%溴酚藍

          20%甘油

          不含DTT2×SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫,應在臨用前取1mol/L貯存液現加于上述緩沖液中。



          3.凝膠加樣緩沖液

          緩沖液類型

          緩沖液

          貯存溫度


          0.25%溴酚藍


          4

          0.25%二甲苯青FF

          40%W/V)蔗糖水溶液


          0.25溴酚藍


          室溫

          0.25%二甲苯青FF

          15%聚蔗糖(Ficoll400)


          0.25%溴酚藍


          4

          0.25%二甲苯青FF

          30%甘油水溶液


          0.25%溴酚藍


          4

          40%(W/V)蔗糖水溶液

           

          堿性加樣緩沖液:

           

          300mmol/L NaOH

          6mmol/L EDTA


          18%聚蔗糖(Ficoll400)


          4

          0.15%溴甲酚綠

          0.25%二甲苯青FF

          使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三:增大樣品密度;以確保DNA均勻進入樣品孔內;使樣品呈現顏色,從而 使加樣操作更為便利,含有在電塊中能以可預知速率向陽極泳動的染料。溴酚藍在瓊脂糖中移動的速率約為二甲苯青FF2.2倍,而與瓊脂糖濃度無關。以 0.5×TBF作電泳液時,溴酚藍在瓊脂糖中的泳動速率約與長300bp的雙鏈線狀DNA相同,而二甲苯青FF的泳動則與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。 在瓊脂糖濃度為0.5%1.4%的范圍內,這些對應關系受凝膠濃度變化的影響并不顯著。

          選用哪一種加樣染料純屬個人喜惡。但是,對于堿性凝膠應當使用溴甲酚綠作為示蹤染料,因為在堿性pH條件下其顯色較溴酚更藍為鮮明。



          4.各種pH值的Tris緩沖液的配制

          各種pH值的Tris緩沖液的配制

          所需pH值(25℃)

          0.1mol/L HCl的體積

          71

          457

          72

          447

          73

          434

          74

          420

          75

          403

          76

          385

          77

          366

          78

          345

          79

          320

          80

          292

          8.1

          26.2

          8.2

          22.9

          8.3

          19.9

          8.4

          17.2

          8.5

          14.7

          8.6

          12.4

          8.7

          10.3

          8.8

          8.5

          8.9

          7.0

          某一特定pH值的0.05mol/L Tris緩沖液的配制:將50ml 0.1mol/L Tris堿溶液與上表所示相應體積(單位:ml)的0.1ml/L HCl混合,加水將體積調至100ml


          2)溫度對50mmol/L Tris·HClpH值的影響

          4

          25

          37

          81

          75

          72

          82

          76

          73

          83

          77

          74

          84

          78

          75

          85

          79

          76

          86

          80

          77

          87

          81

          78

          88

          82

          79

          89

          83

          80

          90

          84

          81

          91

          85

          82

          92

          86

          83

          93

          87

          84

          94

          88

          85



          5. 常用緩沖液的pKa

          緩沖液

          分子量

          pKa

          緩沖范圍

          Trisa

          12.1

          8.08

          7.17.9

          HEPESb

          283.3

          7.47

          7.28.2

          MPOSc

          209.3

          7.15

          6.67.8

          PIPESd

          304.3

          6.76

          6.27.3

          MESe

          195.2

          6.09

          5.46.8


          a:三羥甲基氨基甲烷;bN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸;c3-N-嗎啉代)丙磺酸;dN,N’-雙(2-乙磺酸)哌嗪;e2-N-嗎啉代)乙磺酸。


          6.溫度對常用緩沖液pH的影響

          緩沖體系

          pKa(20)

          pKa/10

          Mes

          6.15

          -0.110

          Ada

          6.60

          -0.110

          PiPes

          6.80

          -0.085

          Aces

          6.90

          -0.200

          Bes

          7.15

          -0.160

          Mops

          7.20

          -0.013

          Tes

          7.50

          -0.200

          Hepes

          7.55

          -0.014

          Tricine

          8.15

          -0.210

          Tris

          8.30

          -0.310

          Bicine

          8.35

          -0.180

          Glycylglycine

          8.40

          -0.280


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